Análisis del daño genético producido en queratinocitos humanos traducidos con los oncgenes virales E5, E6, E7 del VPH-18 sometidos a un microambiente hipóxico

Abstract

Objetivos. En este estudio se evaluarán los niveles de estrés oxidativo, y daño en el ADN en un modelo celular de carcinogénesis oral temprano, sometido a un microambiente hipóxico.
Métodos. Utilizamos queratinocitos humanos (HaCaT) transducidos con oncogenes de VPH-18 (E5/E6/E7) sometidos a un microambiente hipóxico mediante el método del cubreobjeto, Se estudió mediante microscopía confocal la detección de especies reactivas de oxigeno (ROS) utilizando una sonda fluorescente. Además, se midieron los niveles de producción de óxido nítrico (NO), mediante el ensayo de Griess. Se evaluó el daño al ADN generado en las líneas celulares HaCaT parental, y HaCaT E5/E6/E7-VPH18, en normoxia, y en hipoxia mediante inmunocitoquímica de γH2AX, y ensayo cometa. Finalmente, se evaluaron diferencias morfológicas celulares y nucleares en ambas líneas celulares, en normoxia e hipoxia, utilizando el microscopio Nanolive 3D Cell Explorer-Fluo.
Resultados. Observamos niveles de ROS intracelular significativamente más altos en células HaCaT E5/E6/E7-VPH-18 encomparación con las células HaCaT parentales. En cuanto al contenido de NO, fue significativamente mayor en HaCaT E5/E6/E7-VPH18 cultivadas en hipoxia en comparación con las células HaCaT en hipoxia. Además, las células HaCaT E5/E6/E7-VPH18 presentaron mayor daño genético medido por la intensidad de fluorescencia γH2Ax, y por el ensayo cometa, en hipoxia en comparación con 
normoxia. Finalmente, observamos diferencias morfológicas nucleares, y una mayor compactación de la cromatina en ambas líneas celulares, en hipoxia, en relación a normoxia.
Conclusiones. Nuestros resultados sugieren que los oncogenes E5/E6/E7 del VPH-18 cooperan con un microambiente alterado, promoviendo estrés oxidativo, daño genético y alteraciones morfológicas que podrían facilitar la transformación maligna.